Entwicklung eines Proteinhydrolyseverfahrens zur Erhöhung des Nährwerts von frisch zubereitetem Fleisch und Fisch.

Ein wissenschaftliches Begleitpapier von Dr. Adrian Hewson-Hughes | Berater für Ernährung, Lebensmittelsicherheit und Innovation, GA Pet Food Partners.

Einleitung.

Der Gehalt an tierischem Eiweiß ist bekanntlich das A und O eines hochwertigen Hunde- und Katzenfutters, und viele Tierhalter erkennen, dass hier das Sprichwort "Qualität vor Quantität" gilt. Nach Angaben des Marktforschungsunternehmens Mintel sagen 59 % der Katzenbesitzer und 57 % der Hundebesitzer, dass die Qualität des Fleisches wichtiger ist als der Gesamtfleischgehalt im Tierfutte (MINTEL, 2017).

GA Pet Food Partners hat dies schon lange erkannt. Seit der Einführung von Freshtrusion® ist GA führend in der Entwicklung und Herstellung von Futtermitteln, die immer größere Mengen an frisch zubereiteten Fleisch- und Fischproteinquellen enthalten. Die Vorteile der Verwendung von frischem Fleisch und Fisch gegenüber getrockneten, ausgeschmolzenen Fleisch- und Fischmahlzeiten, einschließlich des besseren Geschmacks und der besseren Verdaulichkeit, werden sowohl von Haustieren als auch von ihren Besitzern sehr geschätzt.

Wir streben danach, unseren Partnern noch bessere Produkte anzubieten.

Der Markt für Heimtiernahrung ist sehr dynamisch, und obwohl es ein kluger Schritt ist, den hohen Fleisch-, Fisch- und Geflügelanteil in den Produkten hervorzuheben, wird dies immer mehr zu einer Grunderwartung und nicht zu der von den Tierhaltern gewünschten Qualität für diese Produkte. Wir bei GA sind ständig auf der Suche nach Möglichkeiten, unseren Partnern noch bessere Produkte zu bieten. Deshalb haben wir uns vorgenommen, das scheinbar Unmögliche möglich zu machen - eine Möglichkeit zu finden, unsere frischen Fleisch- und Fischzutaten so zu kochen, dass sie noch besser für Haustiere sind.

Die Idee besteht darin, den Nährwert des Proteins in unseren frischen Fleisch- und Fischzutaten zu erhöhen, indem das Protein in kleine Peptide umgewandelt wird, die von den Tieren, die es fressen, leichter aufgenommen werden können (wir nennen es "HDP" - Highly Digestible Protein). Um uns dabei zu helfen, haben wir Experten von Nofima, einem führenden Forschungsinstitut für angewandte Lebensmittelforschung mit Sitz in Norwegen, beauftragt, die Bedingungen für den enzymatischen Aufschluss ausgewählter Fleisch- und Fischrohstoffe zu optimieren und zu analysieren, um zu zeigen, dass wir unsere Ziele erreichen können.

Proteinverdauung - auch Proteolyse oder Hydrolyse genannt

Proteine sind große Moleküle, die aus einzelnen "Bausteinen", den Aminosäuren, bestehen. Nach dem Verzehr eiweißhaltiger Lebensmittel beginnt der Prozess der Proteolyse, bei dem Enzyme, die in verschiedenen Teilen des Magen-Darm-Trakts freigesetzt werden, das Eiweiß in Aminosäuren und kleine Peptide zerlegen. Dadurch können diese Bausteine in den Körper aufgenommen werden, wo sie zum Aufbau neuer Proteine (wie Muskeln, Haut, Haare, Antikörper, Enzyme, Hormone usw.) neu kombiniert werden können.

Es ist auch möglich, dass Proteinquellen als Teil ihrer Vorbereitung für die Verwendung in Lebensmitteln und Ernährungsprodukten einem kontrollierten enzymatischen Proteolyseprozess unterzogen werden. Beispielsweise werden Proteinhydrolysate seit Jahrzehnten in der menschlichen Ernährung verwendet, insbesondere bei der Herstellung von hypoallergenen Säuglingsmilchnahrungen für Babys/Kinder, die auf Kuhmilchprotein allergisch reagieren.

Enzymatische oder chemische Hydrolyse

Die Proteinhydrolyse - das Aufbrechen der Peptidbindungen, die die Aminosäuren miteinander verbinden, durch Zugabe von Wasser - kann mit verschiedenen Methoden erfolgen: chemisch mit Säuren oder Basen (alkalisch) oder enzymatisch (der Ansatz, auf den wir uns konzentrieren). Die Methoden der sauren und alkalischen Hydrolyse von Proteinen bieten zwar den Vorteil, dass sie kostengünstig sind, haben jedoch negative Auswirkungen auf die ernährungsphysiologische Qualität der erzeugten Hydrolysate. Die saure Hydrolyse führt zu einer vollständigen Zerstörung der essenziellen Aminosäure Tryptophan sowie zu einem teilweisen Verlust von Methionin, Cystin und Cystein (Pasupuleki & Braun, 2010). In ähnlicher Weise führt die alkalische Hydrolyse zur vollständigen Zerstörung der meisten Aminosäuren, obwohl Tryptophan intakt bleiben kann (Dai, et al., 2014), (Hau, et al., 2017).

Im Vergleich zur sauren und alkalischen Hydrolyse hat die enzymatische Hydrolyse von Proteinen vor allem folgende Vorteile:

  1. Die Hydrolysebedingungen wie Temperatur und pH-Wert sind mild und führen zu keinem bekannten Verlust an Aminosäuren.
  2. Die Verwendung von Protease-Enzymen ist spezifischer und präziser bei der Kontrolle des Ausmaßes der Hydrolyse und der Größe der Peptide.
  3. Die geringen Mengen des verwendeten Enzyms können leicht deaktiviert werden (z. B. durch Erhitzen auf 80-85 ºC für mindestens 3 Minuten), um die Hydrolysereaktion zu stoppen. (Hau, et al., 2017).

Ernährungsphysiologische Vorteile von enzymatisch hydrolysiertem Eiweiß: Verdaulichkeit und Aufnahme von Eiweiß.

Wie bereits erwähnt, hängt der Nährwert von Proteinhydrolysaten nicht nur von der angewandten Methode der Proteinhydrolyse ab, sondern auch von der Zusammensetzung der freien Aminosäuren, der kleinen Peptide (typischerweise Di- und Tri-Peptide) und der großen Peptide. Früher ging man davon aus, dass nur freie Aminosäuren durch spezifische Aminosäuretransporter aus dem Magen-Darm-Trakt aufgenommen werden. Dies ist auch der Fall, aber man weiß heute, dass die meisten Aminosäuren als Di- und Tri-Peptide durch den Peptidtransporter PepT1 mit breiter Spezifität aufgenommen werden (Fei, et al., 1994) PepT1 kann potenziell alle 400 Di-Peptide und 8,000 Tri-Peptide transportieren, die sich aus der Kombination der 20 verschiedenen Aminosäuren in der Nahrung ergeben (Daniel, 2004). Daher wäre zu erwarten, dass die Aufnahme eines Proteinhydrolysats mit einem hohen Anteil an Di- und Tri-Peptiden die Proteinverdauung und -absorption erleichtern würde, was zu einer erhöhten Verdaulichkeit und Bioverfügbarkeit der Aminosäuren führen würde.

Es liegt auf der Hand, dass die Festlegung der besten Enzym- und Hydrolysebedingungen von entscheidender Bedeutung ist, um Proteinhydrolysate mit den gewünschten endgültigen Peptidgrößenprofilen herstellen zu können. Die Peptidgrößenverteilung kann mit einer Technik namens Größenausschlusschromatografie bestimmt werden. Die Größenausschlusschromatografie (SEC) ist ein Verfahren der analytischen Chemie, bei dem in einer Lösung gelöste Molekülmischungen (z. B. Proteine oder Peptide) nach ihrer Größe getrennt werden (wie in Abbildung 1 skizziert).

ABBILDUNG 1. Einfacher Überblick über die Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe in einer Lösung durch Größenausschlusschromatographie (SEC). Die Lösung wird auf eine Säule aufgetragen, die mit einem Harz aus porösen kugelförmigen Perlen (graue Kugeln) gefüllt ist. Große Moleküle (rote Kreise) können nicht in die Poren (Löcher) der Kügelchen eindringen und laufen daher relativ schnell die Säule hinunter und werden zuerst nachgewiesen. Kleinere Moleküle in der Probe können je nach ihrer Größe in unterschiedlichem Maße in die Poren eindringen. Mittelgroße" Moleküle (grüne Kreise) können in einige Beads eindringen, in andere jedoch nicht, so dass sie länger brauchen, um durch die Säule zu gelangen, während die kleinsten Moleküle (blaue Kreise) in alle Poren eindringen können und am längsten brauchen, um durch die Säule zu gelangen.

Methoden

Rohstoffe Frische Proben von Hühner-, Enten- und Lachskarkassen wurden zerkleinert, zu einer dicken Paste homogenisiert und eingefroren. Frische Lammleber wurde ganz eingefroren. Die Materialien wurden an Nofima, Ås, Norwegen, zur Proteolyse und Analyse geschickt.

Proteolyse Für jeden Rohstoff (Huhn, Ente, Lachs und Lamm) wurde eine 500 g schwere Probe mit 990 ml destilliertem Wasser in einem Glasreaktionsgefäß vermischt und bei 300 U/min gerührt. Für jedes Rohmaterial wurden drei verschiedene Proteaseenzyme in zwei verschiedenen Konzentrationen und zu zwei Zeitpunkten getestet, was 48 Hydrolysatproben für die Analyse ergab

Größenausschlusschromatographie – Die Molekulargewichtsverteilung der wasserlöslichen Proteinfraktion der Hydrolysate wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung eines Shimadzu LC-20AT Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems (HPLC) mit einem auf 20 nm eingestellten Photodiodenarraydetektor (SPD M214A) bestimmt.

Gehalt an Kollagenpeptiden Hydroxyprolin ist eine modifizierte Aminosäure, deren Vorhandensein hauptsächlich auf Kollagen beschränkt ist. Der Hydroxyprolingehalt in Proteinhydrolysaten kann als indirektes Maß für die Menge des vorhandenen Kollagens bzw. der Kollagenpeptide verwendet werden. Eine vollständige Aminosäureanalyse (einschließlich Hydroxyprolin) jedes Rohmaterials wurde von Nofima Biolab durchgeführt; darüber hinaus wurde der Hydroxyprolingehalt in der wasserlöslichen Fraktion der Hydrolysate in einem akkreditierten Labor (ALS, Norwegen) bestimmt.

Die Ergebnisse

Peptidgrößenverteilung der Hydrolysate – Im Allgemeinen führte bei jedem getesteten Enzym die Inkubation jedes Rohmaterials mit der höheren Enzymkonzentration und einer längeren Dauer zu einer "vorteilhaften" Verschiebung des Peptidgrößenprofils der Hydrolysate (d. h. zu einer Zunahme des Anteils kleinerer Peptide). Dies wird in Abbildung 2 deutlich, die die Ergebnisse für jedes Rohmaterial unter Verwendung des "besten" Enzyms bei "nicht optimaler" Konzentration und Dauer im Vergleich zu "optimaler" Konzentration und Dauer zeigt. Bei optimierten Bedingungen waren 100 % der Peptide ≤3 kDa und mehr als 75 % < 0.5 kDa (Abbildung 2).

Auf der Grundlage der kollektiven Erkenntnisse aus mehreren Studien an einer Reihe von Tierarten (z. B. Ratte, Schwein, Hund, Mensch; siehe (Zhangi & Matthews, 2010) für einen Überblick) wird allgemein anerkannt, dass:

  • Die Absorption von Peptiden ist im Vergleich zu intaktem Protein besser.
  • Die Absorption von Peptiden ist besser als die von freien Aminosäuren.
  • Die Absorption von kleinen Peptiden ist besser als die von großen Peptiden.

Physiologisch gesehen werden die meisten Aminosäuren als kleine Peptide absorbiert, die aus 2 oder 3 miteinander verbundenen Aminosäuren bestehen (Di- bzw. Tri-Peptide). Daher würde man erwarten, dass die Aufnahme eines Proteinhydrolysats mit einem hohen Anteil an Di- und Tri-Peptiden die Proteinverdauung und -absorption erleichtert, was zu einer erhöhten Verdaulichkeit und Bioverfügbarkeit der Aminosäuren führt. Das durchschnittliche Molekulargewicht einer Aminosäure beträgt 110 Dalton (Da), so dass Di- und Tri-Peptide ein Molekulargewicht von etwa 220-330 Da (0.2-0.3 kDa) aufweisen würden. Unsere Ergebnisse bei der Herstellung von Proteinhydrolysaten mit mehr als 75 % Peptiden unter 0.5 kDa (d. h. bis zu ~ 5 Aminosäuren) bedeuten, dass das Protein in unseren Kroketten hoch verdaulich ist und von den Tieren, die es fressen, leicht aufgenommen werden kann. Es ist geplant, dies in einer Fütterungsstudie in Zusammenarbeit mit der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Gent nachzuweisen.

Wenn 100 % der Peptide 3 kDa oder weniger haben, verringert sich das Risiko einer allergischen Reaktion auf die Proteinquellen und kann daher als hypoallergen angesehen werden.

Abbildung 2.

Größenverteilung (kDa) der Peptide in der Wasserphase der Hydrolysate der einzelnen Rohstoffe, die mit demselben Enzym unter "nicht optimierten" und "optimierten" Bedingungen in Bezug auf die Enzymkonzentration und die Dauer der Hydrolyse inkubiert wurden. Man beachte insbesondere, wie der Prozentsatz der Peptide zwischen 1.0-3.0 kDa abnimmt und Peptide <0.5 kDa zunehmen, wenn man von "nicht optimierten" zu "optimierten" Bedingungen übergeht.

Ente (nicht optimiert)

Ente (optimiert)

Lachs (nicht optimiert)

Lachs (optimiert)

Huhn (nicht optimiert)

Huhn (optimiert)

Lamm (nicht optimiert)

Lamm (optimiert)

Gehalt an Kollagenpeptiden

Bei jedem getesteten Rohstoff schnitten die Enzyme A und C im Allgemeinen "besser" ab (in Bezug auf die Gewinnung eines größeren Prozentsatzes an Hydroxyprolin in der Wasserphase der Hydrolysate) als Enzym B, wenn man eine bestimmte Dauer der Hydrolyse und Enzymkonzentration vergleicht (siehe z. B. die Ergebnisse für Lachs in Abbildung 3).

Da "intaktes" Kollagenprotein nicht wasserlöslich ist, zeigt das Vorhandensein von Hydroxyprolin (unser Marker für "Kollagen") in der Wasserphase an, dass das Kollagenprotein in Kollagenpeptide (die wasserlöslich sind) gespalten wurde. Unsere Ergebnisse zeigen, dass wir durch enzymatische Proteolyse Rohstoffe herstellen können, die durch die in ihnen enthaltenen Kollagenpeptide potenzielle funktionelle Vorteile wie die Unterstützung der Gelenkgesundheit, der Hautgesundheit und der Darmgesundheit bieten.

ABBILDUNG 3.. Prozentualer Anteil von Hydroxyprolin (eine Aminosäure, die fast ausschließlich in Kollagen vorkommt), der in der Wasserphase von hydrolysiertem Lachs mit drei verschiedenen Enzymen (A, B oder C) wiedergewonnen wurde, die mit dem Rohmaterial (Lachs) in zwei verschiedenen Konzentrationen (C1 oder C2) für zwei verschiedene Zeiträume (T1 oder T2) inkubiert wurden.

Konklusion

Diese positiven Ergebnisse bieten die Möglichkeit, aus dem natürlichen Vorhandensein von Kollagen in bestimmten Rohstoffen einen zusätzlichen Nutzen zu ziehen, indem Kollagenpeptide hergestellt werden, die das Potenzial haben, funktionelle Vorteile zu bieten, wie z. B. die Erhaltung gesunder Gelenke bei aktiven Haustieren und die Verbesserung der Mobilität und Flexibilität der Gelenke bei älteren Haustieren.

Mit dem hohen Anteil (>75 %) an kleinen Peptiden (<0,5 kDa), die unter "optimierten" Bedingungen auf der Grundlage dieser Forschung hergestellt wurden, ist der erste Teil unseres HDP-Ziels erreicht. Der nächste wichtige Schritt ist der Nachweis, dass mit diesem HDP hergestelltes Trockenfutter tatsächlich besser verdaulich und bioverfügbar ist als unsere bestehenden, frisch zubereiteten Produkte. Beobachten Sie diese Seite!

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Bibliographie

  1. Cave, N., 2006. Hydrolysierte Proteindiäten für Hunde und Katzen. Tierkliniken Kleintierpraxis, Band 36, S. 1251-1268.
  2. Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analyse der Aminosäurezusammensetzung in Proteinen tierischer Gewebe und Lebensmittel als Vorsäulen-o-Phthaldialdehyd-Derivate durch HPLC mit Fluoreszenzdetektion.. J Chromatography B, Band 964, S. 116-127.
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  10. Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Physiologische Bedeutung und Mechanismen der Absorption von Proteinhydrolysaten. In: Proteinhydrolysate in der Biotechnologie. New York: Springer, S. 135-177.